液相色譜是一種廣泛使用且值得信賴(lài)的樣品分離方法，研究人員在目標純化工作流程中使用該方法。分離的基礎涉及移動(dòng)樣品（在溶液中）與固定相或固相的相互作用，所述固定相或固相將選擇性地捕獲，結合或與樣品中的組分相互作用。色譜法  利用核酸，小分子和大分子以及蛋白質(zhì)的多種化學(xué)和物理特性，從樣品混合物中選擇性地排除或捕獲目標靶標。

基本原則

在大多數情況下，液相色譜法涉及使用填充并保持在柱中的小顆粒或樹(shù)脂（也稱(chēng)為介質(zhì)），也稱(chēng)為固定相。可以對這些顆粒進(jìn)行物理或化學(xué)修飾，以提供在有時(shí)非常復雜的混合物中結合或排斥特定分子的特異性。這些色譜柱可以使用重力運行以移動(dòng)溶液樣品，但更常見(jiàn)的是它們在低，  中  或高壓下操作 - 通過(guò)機械泵和有時(shí)專(zhuān)用儀器來(lái)控制樣品流過(guò)色譜柱中的固定相。有多種色譜樹(shù)脂可用于滿(mǎn)足研究人員不斷變化的需求，以滿(mǎn)足不同的目標分子的需求。

液相色譜可以在分析和制備規模上進(jìn)行。通過(guò)分析方法，目標通常是從復雜混合物中發(fā)現，識別并有時(shí)量化組分。制備液相色譜的重點(diǎn)是分離和純化通常用于下游生物加工步驟的分子。

蛋白質(zhì)純化可能帶來(lái)一些挑戰，并且與任何純化方案一樣，需要協(xié)議優(yōu)化。對于培養基選擇有許多選擇，并且每種色譜方法用于不同的目的，無(wú)論是更一般的分子選擇還是高度特異性的分離。某些目標可能需要使用不同的色譜柱進(jìn)行多個(gè)分離步驟，或采用多模式或混合樹(shù)脂方法來(lái)滿(mǎn)足研究人員的特定需求。

在這里，我們簡(jiǎn)要討論一些用于蛋白質(zhì)純化工作流程的常見(jiàn)液相色譜方法，重點(diǎn)介紹每種方法的介質(zhì)（樹(shù)脂）和主要原理和注意事項。遵循的一般規則是以盡可能少的步驟獲得目標蛋白質(zhì)所需的純度。

色譜和媒體選擇

離子交換色譜
離子交換（IEX）色譜法根據分子的總電荷分離分子。該技術(shù)是一種功能強大的方法，可用于純化的分析階段和制備階段。離子交換樹(shù)脂通過(guò)將帶正電或帶負電的官能團共價(jià)連接到固體基質(zhì)而產(chǎn)生。一些常用的基質(zhì)包括纖維素，瓊脂糖，聚甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯和聚丙烯酰胺。將蛋白質(zhì)樣品以低離子強度加載到IEX柱上，然后用增加離子強度/鹽的緩沖液洗滌以除去不需要的蛋白質(zhì)和雜質(zhì); 使用確定的鹽梯度或pH的變化洗脫目標靶蛋白。通過(guò)鹽梯度洗脫依賴(lài)于帶電鹽離子與帶電樹(shù)脂的結合靶競爭的事實(shí)。具有較少帶電基團的靶標傾向于在較低鹽濃度下洗脫，具有較多帶電基團的靶標在較高鹽濃度下洗脫。緩沖條件對于該方法是關(guān)鍵的，并且樣品通常在低鹽條件下加載到柱上。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟。或者，通過(guò)pH洗脫利用靶蛋白的等電點(diǎn)（pI）。當呈現給樣品的pH達到目標靶的pI時(shí)，它不再帶有凈電荷并被樹(shù)脂釋放。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟。或者，通過(guò)pH洗脫利用靶蛋白的等電點(diǎn)（pI）。當呈現給樣品的pH達到目標靶的pI時(shí)，它不再帶有凈電荷并被樹(shù)脂釋放。對于某些樣品，這可能需要在加載到IEX色譜柱之前進(jìn)行緩沖液交換步驟。或者，通過(guò)pH洗脫利用靶蛋白的等電點(diǎn)（pI）。當呈現給樣品的pH達到目標靶的pI時(shí)，它不再帶有凈電荷并被樹(shù)脂釋放。
對于諸如單克隆抗體的靶標，IEX是有效的第二純化步驟; 親和色譜（見(jiàn)下文）通常是純化工作流程的初始步驟。對于非抗體分子，大珠IEX樹(shù)脂是**柱純化步驟的良好起點(diǎn)。

疏水相互作用色譜
疏水相互作用色譜（HIC）基于其疏水性分離蛋白質(zhì)。HIC通常用于分離或純化蛋白質(zhì)，同時(shí)保持其生物活性，因為該技術(shù)利用比其他純化方法對樣品變性更小的緩沖液，基質(zhì)和參數。鹽濃度，pH和溫度都可以影響與介質(zhì)的結合相互作用以及固定在樹(shù)脂上的配體化學(xué)。該方法是互補的，通常與上游高鹽IEX洗脫或下游大小排除（見(jiàn)下文）純化程序結合使用。

尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法（SEC）通過(guò)凝膠過(guò)濾基于其大小分配蛋白質(zhì)。凝膠由含有特定尺寸孔的球形珠組成，所述孔包括或排除來(lái)自介質(zhì)內孔的分子。當蛋白質(zhì)通過(guò)柱子時(shí)，蛋白質(zhì)的分離按大小發(fā)生，并按分子量降低的順序洗脫。**常用的兩種SEC方法是分餾和脫鹽/緩沖交換蛋白。SEC通常用于分離可能無(wú)法通過(guò)其他方法解析的蛋白質(zhì)，例如IEX或HIC。研究人員可以選擇保留SEC以進(jìn)行**后的純化步驟。

親和層析
親和層析利用固定在樹(shù)脂上的配體與其結合配偶體之間的特異性結合相互作用。結合/純化通常是高度選擇性的并且利用靶蛋白的生物結構或功能。該方法的典型應用包括抗體/抗原，酶/底物和酶/抑制劑相互作用。通過(guò)該方法可以純化天然以及重組產(chǎn)生的分子。除了提供更高的選擇性外，由于特定的相互作用，親和色譜可以提供更快的結果時(shí)間。根據具體的純度目標，親和色譜通常是純化工作流程方案中的**步，如果不是**的步驟。

多模式或混合模式色譜
多峰或混合模式色譜法利用已經(jīng)用能夠多重相互作用的配體官能化的樹(shù)脂。當純化不具有已知特異性的靶蛋白時(shí)，該方法是有用的。該樹(shù)脂可用于篩選，純化和潛在地鑒定靶蛋白上的位點(diǎn)，其可提供有用的親和力和選擇性信息。然而，由于存在多種結合和洗脫特性，因此不能通過(guò)簡(jiǎn)單的氨基酸序列分析預測目標相互作用，并且需要對結合和洗脫條件優(yōu)化進(jìn)行前期實(shí)驗。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是在單一介質(zhì)中結合互補色譜方法，可以節省純化步驟和珍貴的樣品材料，同時(shí)還可以提供更快的結果時(shí)間，

蛋白質(zhì)純化的許多選擇

從復雜樣品中分離目標蛋白質(zhì)可能非常具有挑戰性。純化步驟是進(jìn)一步表征和理解靶蛋白功能的關(guān)鍵和必要過(guò)程。優(yōu)化工作流程過(guò)程涉及許多變量。通常，**好從目標的一級氨基酸序列開(kāi)始。這將提供有關(guān)分子量（作為SEC指南）和pI（作為IEX指南）的信息，并幫助預測和“評分”蛋白質(zhì)的溶解度特征。選擇合適的色譜介質(zhì)以及洗滌和洗脫緩沖液條件可以極大地幫助純化過(guò)程。當目標靶的性質(zhì)未被充分理解時(shí)，還存在多峰或混合模式樹(shù)脂。如需其他幫助，疏水性圖和二級結構預測也可以在考慮HIC或混合模式樹(shù)脂時(shí)提供指導。具有無(wú)序二級結構的靶（特別是在末端）通常不穩定或易于聚集，并且它們與HIC介質(zhì)良好相互作用。