固定細胞成像技巧

你準備好從你的免疫熒光實(shí)驗中創(chuàng )建令人大開(kāi)眼界和可發(fā)表的圖像嗎？了解免疫熒光方案的基本步驟將幫助您生成**能傳達數據的圖像，這些提示可以使圖像成為一件藝術(shù)品。

不幸的是，沒(méi)有一種**的染色固定細胞方案，因此需要優(yōu)化新抗體的方案。從長(cháng)遠來(lái)看，找到有關(guān)哪些條件與抗體 - 抗原組合良好協(xié)作的信息可能會(huì )有很大幫助。一點(diǎn)點(diǎn)的前期文獻搜索是值得的，它節省了令人驚嘆的圖像。

染色細胞用于成像有六個(gè)基本步驟：樣品制備，固定，透化，阻斷，抗體孵育和安裝。以下是一些有助于優(yōu)化每個(gè)步驟結果的提示。

1.樣品制備

必須具備正確培養基，血清，溫度和CO2濃度的孵育條件。另外請記住您正在生長(cháng)它們的基材以及它對您的成像平臺的作用。通常，這意味著(zhù)在培養皿或培養皿中涂覆的蓋玻片上培養細胞，但它也可能意味著(zhù)在多孔板，懸浮液瓶中或3D細胞培養物中生長(cháng)。直立式顯微鏡通常需要蓋玻片上的細胞，而倒置系統也可以在多孔板或培養皿中成像細胞。

在開(kāi)始免疫熒光方案之前，請始終檢查細胞的一般健康狀況和融合情況。你有足夠的細胞嗎？它們是否具有預期的形態(tài)，或者它們是否起泡，變圓或從基材上脫落？

提示＃1 - 在開(kāi)始優(yōu)化成像之前，要知道您的細胞表達抗體的抗原。  這似乎很簡(jiǎn)單，但你會(huì )驚訝于許多研究人員在跳轉到抗體 - 抗原組合的免疫熒光染色之前忘記做一個(gè)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)印跡。

提示＃2 - 優(yōu)化緩沖區。經(jīng)常被忽視的優(yōu)化領(lǐng)域之一是緩沖區選擇。在固定和透化后的孵育和洗滌期間使用緩沖液; 使用正確的緩沖區可以對信號強度產(chǎn)生很大影響。大多數科學(xué)家自動(dòng)轉向PBS以滿(mǎn)足其染色需求，但pHEM或CSK等緩沖液（通常在較低pH值下使用）可能對細胞骨架或細胞質(zhì)抗原有幫助。

2.固定。

通過(guò)所有這些孵化和洗滌盡可能保持細胞完整是既棘手又極其重要的。固定是維持細胞結構的關(guān)鍵步驟。許多商業(yè)銷(xiāo)售的一抗已經(jīng)用特定的固定劑驗證，但是新抗體需要建立優(yōu)化的方案。

有兩類(lèi)固定劑可供選擇：醛固定劑和有機溶劑。醛固定在細胞骨架和膜內使蛋白質(zhì)彼此交聯(lián)，因此是在這些結構中標記抗原的選擇方法。然而，這種方法化學(xué)修飾蛋白質(zhì)并且可以掩蓋它們，使得檢測更加困難。一個(gè)很好的起點(diǎn)是基于甲醛的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒，適用于大多數細胞類(lèi)型。有機溶劑，如甲醇，乙醇和丙酮，不會(huì )通過(guò)交聯(lián)改變蛋白質(zhì)，但它們會(huì )使蛋白質(zhì)變性和沉淀。這種方法可能對那些具有“埋藏”抗原的抗體有益，例如在細胞核中。

提示＃3-不要使用有機溶劑來(lái)固定含有熒光蛋白標簽的細胞。   這可能使您標記的融合蛋白變性，使您無(wú)信號。

提示＃4 - 反作用固定劑誘導的自發(fā)熒光。  一些樣品易于發(fā)生固定誘導的自發(fā)熒光，這可以通過(guò)用10mM的BH 4或NH 3 Cl 還原醛基來(lái)減輕。戊二醛對自發(fā)熒光特別不利。

提示＃5 - 可能需要抗原檢索方法。  如果抗原被掩蔽，例如通過(guò)醛交聯(lián)，則通常可以通過(guò)用熱，壓力和/或特殊緩沖液（例如檸檬酸鹽緩沖液）處理來(lái)掩蓋抗原。已經(jīng)公布了對這些方法的大量評論，并且有時(shí)商業(yè)抗體來(lái)源將推薦一種方法。

3.滲透性

透化有助于通過(guò)脫脂膜使抗體通過(guò)細胞膜和固定細胞內部。有許多不同的洗滌劑可用于透化細胞，包括NP-40，Triton X-100，Tween-20和皂苷。

所需的透化程度取決于抗原的位置和所需的外顯深度。例如，如果您感興趣的蛋白質(zhì)位于細胞表面或細胞外基質(zhì)中，那么您可能不需要太多透化，如果有的話(huà)。事實(shí)上，你可以通過(guò)這個(gè)程序去除膜，從而失去膜結合蛋白。然而，細胞間靶標需要一些透化方法以使抗體到達抗原。需要優(yōu)化時(shí)間和濃度，但一個(gè)很好的起點(diǎn)是基于TritonX-100的Image-iT®固定/滲透穩定試劑盒。

提示＃6-優(yōu)化固定和透化方法。通過(guò)在不同的時(shí)間和濃度嘗試不同的化合物來(lái)做到這一點(diǎn)。您正在尋找良好的細胞或組織形態(tài)和強烈的特定染色。文獻檢索有時(shí)也可以證明是有用的。

4.阻止

由于非特異性蛋白質(zhì)結合，通過(guò)阻斷抗體與樣品的非特異性結合，可以改善任何免疫熒光染色。牛血清白蛋白和熱滅活的正常血清可用作非特異性阻斷劑，并且還有一些可用于此目的的商業(yè)產(chǎn)品，例如BlockAid TM阻斷溶液。在抗體孵育之前以及在一抗孵育溶液中施加封閉溶液。

提示＃7-仔細選擇阻斷劑。  不要使用與產(chǎn)生一抗的物種相同的血清。什么都不會(huì )擺脫那個(gè)背景！

提示＃8-可能需要額外的阻塞解決方案。  使用Image-iT FX信號增強器可以阻止由染料電荷引起的非特異性結合。專(zhuān)門(mén)的方法，如酶促或生物素 - 抗生物素蛋白擴增，也需要阻斷一些細胞和組織中常見(jiàn)的內源性過(guò)氧化物酶，磷酸酶或生物素。

5.抗體孵育

實(shí)際的檢測步驟包括用**抗體和染料綴合的第二抗體沐浴細胞或組織。同樣，必須仔細優(yōu)化**終濃度和孵育時(shí)間，但是對于培養細胞的顯微鏡檢查，通常在室溫下在0.5-10μg/ mL的范圍內持續30-60分鐘。多個(gè)一抗也可以在一個(gè)步驟中組合。 

通常用針對一抗的宿主物種的染料綴合的二抗檢測一抗。當組合多種一抗時(shí)，確保不同的二級抗體與其他物種交叉吸附，否則它們會(huì )交叉標記，導致信號混亂。確保使用的染料與顯微鏡可用的過(guò)濾器選項和/或激光線(xiàn)匹配，并且是具有明亮和光穩定性的染料，例如Alexa Fluor染料。

提示＃9-為您的目標使用**好的一抗。這是該過(guò)程中**重要的部分之一。如果做得好，您將獲得明亮，特定的污漬準備出版。**的抗體將具有良好的親和力和特異性。值得研究和支付**好的抗體。如果生成自己的，請花時(shí)間設計抗體。從長(cháng)遠來(lái)看，它會(huì )得到回報。確保它不老和退化！

提示＃10-使用適當的控件。您將需要非初級（僅次級）對照來(lái)測試二抗的特異性。沒(méi)有抗體或染料的對照也將測試自發(fā)熒光。如果使用多種一抗，則進(jìn)行單抗體對照以測試交叉標記。

5.安裝

如果您的染料之后不穩定，那么通過(guò)所有這些步驟和優(yōu)化的重點(diǎn)是什么？一旦**終洗滌完成，標記的樣品將需要處于**佳保留染料信號的成像環(huán)境中。雖然細胞可以在緩沖液或緩沖液/甘油溶液中成像，但**好的選擇是將細胞置于防褪色安裝介質(zhì)中，這將保留初始信號并減少光漂白（由于曝光而變暗）并且具有足夠高的折射率實(shí)現**的分辨率。

提示＃11-選擇**適合您成像時(shí)間線(xiàn)的防褪色劑。  如果您立即成像然后丟棄幻燈片，您的封固劑可以保持液態(tài)，例如SlowFade（R）Diamond。但是，如果您希望將幻燈片存檔**或更長(cháng)時(shí)間并在以后拍攝圖像，則需要使用硬化或“固化”的固定劑，例如ProLong（R）Diamond。