使用傳統的光學(xué)顯微鏡，光的衍射將成像分辨率限制在約250納米。在下面提到的一種方法中，超分辨率技術(shù)有時(shí)可以將其提高10倍或更多。今天，這項技術(shù)涉及多種方法，但主要有三種：?jiǎn)畏肿佣ㄎ伙@微鏡，包括光活化定位顯微鏡（PALM）和隨機光學(xué)重建顯微鏡（STORM）; 結構照明顯微鏡（SIM），雖然一些專(zhuān)家指出，SIM的分辨率只能與良好的共聚焦顯微鏡相媲美; 和受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）。

“不幸的是，決定采用哪種超分辨率方法并沒(méi)有簡(jiǎn)單的規則，”英國牛津大學(xué)的Henry Wellcome博士后，Mathew Stracy說(shuō)。“每個(gè)人都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。”

科學(xué)家們使用各種技術(shù)為特定項目選擇正確的方法。“找到解決問(wèn)題的**簡(jiǎn)單的解決方案，”海法以色列理工學(xué)院TEChnion生物醫學(xué)工程助理教授Yoav ShEChtman說(shuō)。“在生物成像環(huán)境中，關(guān)鍵考慮因素包括：所需的空間和時(shí)間分辨率，對光損傷的敏感性，標記能力，樣品厚度 - 這是2D還是3D問(wèn)題？ - 背景熒光水平，或細胞自發(fā)熒光。”

超級資源的ABCs

超分辨率顯微鏡的形式以不同的方式工作。例如，對于PALM和STORM，在任何給定時(shí)刻，只有一小部分分子上的熒光標記被打開(kāi)或光活化，從而允許它們以高精度獨立定位。對所有熒光標記執行此過(guò)程可構建完整的超分辨圖像。“PALM / STORM系統相對容易構建，但更難以應用，因為熒光團必須是可光活化的，”馬克斯普朗克生物物理化學(xué)研究所主任，2014年諾貝爾化學(xué)獎獲得者之一Stefan Hell說(shuō)。用于超分辨率成像。“他們的局限在于他們需要在細胞背景中檢測單個(gè)熒光分子。”他補充說(shuō)，這些技術(shù)“使用的可靠性不如STED”。

使用SIM，光的干涉圖案在成像期間在樣品上產(chǎn)生網(wǎng)格。基于傅里葉變換的圖像和算法之間的網(wǎng)格轉換使用結果信息來(lái)定位特征。

STED使用激光脈沖打開(kāi)熒光團，另一個(gè)打開(kāi)熒光團。在樣本上掃描焦點(diǎn)以生成圖像。“STED的優(yōu)勢在于它是一種按鍵技術(shù)，”Hell解釋道。“它幾乎可以像標準的共聚焦熒光顯微鏡一樣使用。”它還能用一些熒光團成像活細胞，如綠色或黃色熒光蛋白和硅羅丹明衍生染料。

埃默里大學(xué)的助理科學(xué)家尼爾&midDOt;安東尼在考慮使用哪種超級分辨率時(shí)說(shuō)，“這一切都必須逐案考慮。”他指出，PALM和STORM“對活細胞不太好” ，“但STED可用于活細胞或固定細胞。

評估參數

盡管所有超分辨率技術(shù)都超過(guò)了傳統光學(xué)顯微鏡的分辨率，但有些技術(shù)比其他技術(shù)獲得了更多的收益。SIM大致將分辨率提高一倍，降**約100納米。PALM和STORM可以解析大約15納米的特征。地獄表示，STED“可以在活細胞中提供低**30納米的空間分辨率，在固定細胞中提供15納米的空間分辨率。”

在評估具體應用時(shí)，還必須考慮單噪比。在某些情況下，較低的分辨率但較高的單噪比會(huì )產(chǎn)生比更好的分辨率更好的圖像，但會(huì )降低單一噪聲比。

獲取圖像的速度在某些應用中很重要，尤其是具有活細胞的應用。“所有的超分辨率技術(shù)都比傳統的熒光成像慢，”Stracy說(shuō)。“PALM / STORM是**慢的，需要數萬(wàn)幀才能獲得單個(gè)圖像，SIM每張圖像需要數十幀，而STED是一種掃描技術(shù)，因此采集速度取決于視場(chǎng)的大小。”

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除了成像活細胞或固定細胞外，一些科學(xué)家還想知道事物是如何移動(dòng)的。例如，Stracy“對觀(guān)察活細胞中生物系統的動(dòng)態(tài)感興趣，而不僅僅是靜態(tài)圖像，人們通常將其與顯微鏡聯(lián)系起來(lái)。”他可以用PALM結合活細胞中的單粒子跟蹤來(lái)分析動(dòng)力學(xué)。通過(guò)這種方式，Stracy說(shuō)他可以“直接跟蹤標記分子，因為它們在細胞中發(fā)揮作用。”STED加熒光相關(guān)光譜也可用于觀(guān)察標記分子在STED成像體積中移動(dòng)。“另一方面，SIM不適合研究這些分子水平的動(dòng)態(tài)過(guò)程，但由于它的獲取速度相對較快，因此非常適合觀(guān)察細胞中較大結構的動(dòng)態(tài)，例如整個(gè)染色體，幾分鐘后，“他說(shuō)。

一到一個(gè)

2017年，Hell的團隊報道了MINFLUX超分辨率顯微鏡。1 “這種超分辨率方法通常在真正的分子尺度上實(shí)現了**次空間分辨率，1納米，”Hell說(shuō)。“此外，它允許跟蹤活細胞中的單個(gè)分子，其速度**少比以前任何其他方法高100倍。”

MINFLUX-具有1納米的分辨率 - 清楚地分辨出八個(gè)彼此分開(kāi)約11納米的不同分子。（圖片由Francisco Balzarotti，Yvan Eilers，Klaus Gwosch，ArvidGynnå，Volker WestpHal，FernanDO Stefani，Johan Elf和Stefan Hell提供。）

其他科學(xué)家也宣稱(chēng)了MINFLUX超分辨率顯微鏡的價(jià)值。根據ShEChtman的說(shuō)法，“新的應用程序和方法開(kāi)發(fā)不斷涌現，但我想到了兩個(gè)令人興奮的進(jìn)展。”他說(shuō)，其中一個(gè)是MINFLUX。他說(shuō)，在描述它的好處時(shí)，“利用一種巧妙的方法，以極高的精度和非常有限的光子預算獲得分子定位。”

作為第二個(gè)令人興奮的近期進(jìn)展，Shechtman指出，WE Moerner--也是2014年諾貝爾化學(xué)獎的超分辨率成像獲獎?wù)咧?- 以及他的斯坦福大學(xué)同事改進(jìn)了成像分辨率，這可能受到各向異性發(fā)射的限制。熒光單分子。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Shechtman說(shuō)，Moerner實(shí)驗室的科學(xué)家們通過(guò)使用不同的激發(fā)極化來(lái)測量分子的取向及其位置。或者，他們開(kāi)發(fā)了復雜的光瞳平面工程，完全消除了方向誘導的定位偏差。“ 2-4這些技術(shù)提高了定位結構的能力。

看著(zhù)標簽

在許多超分辨率應用中，標簽確實(shí)有所不同，并且存在一些商業(yè)選擇。例如，總部位于德國的Miltenyi Biotec與Stefan Hell聯(lián)合創(chuàng )辦的初創(chuàng )公司Abberior合作，為超分辨率顯微鏡染料提供定制抗體結合服務(wù)。

在許多超分辨率應用中，標簽確實(shí)有所不同，并且存在一些商業(yè)選擇。

其他公司也提供適用于超分辨率顯微鏡的標簽。例如，ChromoTek營(yíng)銷(xiāo)部門(mén)的ChristopH Eckert說(shuō)：“我們的Nano-Boosters非常小 - 大約15千道爾頓 - 并且具有高度特異性。”這些蛋白質(zhì)與綠色和紅色熒光蛋白（分別為GFP和RFP）和波形蛋白結合。結合蛋白。“結合蛋白來(lái)源于單域羊駝抗體片段，稱(chēng)為V H Hs或納米體，”Eckert解釋說(shuō)。“這些V H Hs結構域非常小，具有優(yōu)異的結合特性，并且可以在不進(jìn)行批次間變化的情況下以恒定的高質(zhì)量生產(chǎn)。”

這些標簽的大小在超分辨率顯微鏡中有所不同。與熒光染料相結合，V H Hs是超分辨率的有用工具。正如埃克特指出的那樣，“小于2納米的表位 - 標記位移可以**大限度地減少連鎖誤差。”他補充說(shuō)，“傳統檢測系統的熒光團距離更遠，通常為15-30納米。”這些標簽適用于一系列超級分辨率技術(shù)，包括SIM，PALM，STORM和STED。

馬里蘭大學(xué)醫學(xué)院助理教授唐愛(ài)慧及其同事使用ChromoTek的GFP-Booster和STORM來(lái)探索神經(jīng)系統的信息傳遞。5在突觸 - 神經(jīng)元交流的地方 - 作者在突觸前和突觸后神經(jīng)元中發(fā)現了分子的納米團簇，這些分子形成了他們所描述的納米柱。科學(xué)家得出結論：“這種結構提示了中樞神經(jīng)系統突觸的簡(jiǎn)單組織原理，以維持和調節突觸效率。”

超分辨率成像的版本和越來(lái)越多的方法將繼續為科學(xué)家提供更接近生物學(xué)的觀(guān)點(diǎn)。在某些情況下，生物學(xué)家甚**可以觀(guān)察細胞的作用 - 同時(shí)打破可見(jiàn)光的衍射極限。

參考

1 Balzarotti，F，et al。“具有**小光子通量的熒光分子的納米分辨率成像和跟蹤”，Science 355：606-612,2017。[PMID：28008086 ]

2 Backer，AS，et al。“使用超分辨率顯微鏡和同時(shí)單分子定向測量增強DNA成像，”Optica 3：3-6,2016。[PMID：27722186 ]

3 Backlund，MP，et al。“使用寬帶超曲面掩模去除單分子顯微鏡中取向誘導的定位偏差”，Nature pHotonics 10：459-462,2016。[PMID：27574529 ]

4 Lew，MD，Moerner，WE。“方位角偏振濾波，用于精確，精確，穩定的單分子定位顯微鏡。”Nano Letters 14：6407-6413,2014。[PMID：25272093 ]

5 Tang，AH，et al。“跨突觸納米柱將神經(jīng)遞質(zhì)釋放與受體結合，”Nature 536：210-214,2016。[PMID：27462810 ]